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      組織培養的接種

      文章作者:zhuobo 發布時間:2020-11-25 16:48:08 瀏覽次數:0

        接種時由于有一個敞口的過程,所以是極易引起污染的時期,這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起,接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內保持定期用1%~3%的高錳酸鉀溶液對設備、墻壁、地板等進行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外,還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧,使空氣中灰塵顆粒沉降下來。

      組培

        無菌操作的步驟

        1.在接種4小時前用甲醛熏蒸接種室,并打開其內紫外線燈進行殺菌;

        2.在接種前20分鐘,打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外線燈;

        3.接種員先洗凈雙手,在緩沖間換好專用實驗服,并換穿拖鞋等;

        4.上工作臺后,用酒精棉球搽拭雙手,特別是指甲處。然后搽拭工作臺面;

        5.先用酒精棉球搽拭接種工具,再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍,然后反復過火尖端處,對培養皿要過火烤干;

        6.接種時,接種員雙手不能離開工作臺,不能說話、走動和咳嗽等;

        7.接種完畢后要清理干凈工作臺,可用紫外線燈滅菌30分鐘,若連續接種,每5天要大強度滅菌一次。

        接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官,經切割或剪裁成小段或小塊,放入培養基的過程。

      組培

        無菌接種步驟

        1.將初步洗滌及切割的材料放入燒杯,帶入超凈臺上,用消毒劑滅菌,再用無菌水沖洗,最后瀝去水分,取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。

        2.材料吸干后,一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀,對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm平方的小塊;莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成只含1~2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械,防止交叉污染。

        3.用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作過程(以試管為例)是:先解開包口紙,將試管幾乎水平拿著,使試管口靠近酒精燈火焰,并將管口在火焰上方轉動,使管口里外灼燒數秒鐘。若用棉塞蓋口,可先在管口外面灼燒,去掉棉塞,再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內,輕輕插入培養基上。若是葉片直接附在培養基上,以放1~3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外,其他尚無統一要求。接種完后,將管口在火焰上再灼燒數秒種。并用棉塞,塞好后,包上包口紙,包口紙里面也要過火。

        褐化

        解決方案:在培養基中添加活性碳可以防止植物組織自身的酚類物質排泌和變褐老化,對形態發生和器官形成有良好作用。一般認為,活性碳主要吸附非極性物質及色素大分子,可以減少一些有害物質的影響,但是具體吸附的選擇性很差,溫度低時吸附力增強,溫度高時吸附力減弱,甚至會解吸附,通常使用濃度為0.5-10g/L。加入活性炭后使培養基變黑,對一些植物誘導生根有利。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力,因此要多加些瓊脂。很細的活性炭容易沉淀,因此通常在瓊脂將要凝固時,需輕輕搖動培養瓶。

        酚污染

        解決方案:植物外植體組織在接種時的切割面會溢泌一些酚類物質,在接觸空氣中的氧氣后,其會氧化為相應的醌類物質,產生可見的茶色、褐色或黑色,此即謂“酚污染”。在木本植物,尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中,此現象較為嚴重。


        常用的防治措施如下

        1、試用抗酚類氧化的藥劑(半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、抗壞血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。用經過濾滅菌的藥液洗滌剛切割的外植體傷口表面,或加入固體培養基的表層,或將剛切割的外植體浸入其中一定時間)

        2、適當降低培養基溫度。

        3、接種后先進行一定時間的暗培養。

        4、及時轉接入新鮮培養基。

        5、選擇切取外植體部位等。


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