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      鐵皮石斛組培苗生根條件優化研究

      文章作者:組培室設計 發布時間:2019-09-27 09:14:42 瀏覽次數:0

        【研究意義】鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)別名鐵皮蘭、黑節草,屬蘭科石斛屬多年生附生草本植物,被譽為藥材之上品。祖傳醫學和現代醫學認為,鐵皮石斛具有健脾養胃、滋陰補腎、潤肺生津等功效;用于治療慢性萎縮性胃炎、高血壓、糖尿病、抗腫瘤、抗衰老等;長期服用具美容、抗衰老和延年益壽之功效(蔡光先等,2011)。由于鐵皮石斛的重要藥用價值和保健作用,近幾十年來人們對野生鐵皮石斛的需求量急劇增加,導致人們掠奪式采集,其資源日趨減少,已被列入植物保護紅皮書(傅立國和金鑒明,1992)。鐵皮石斛人工快繁不僅可以擺脫人們單純依靠采集野生鐵皮石斛的狀態,還對森林生態條件和生物多樣性保護及鐵皮石斛資源持續開發利用均具有重要的現實意義?!厩叭搜芯窟M展】自20世紀70年代以來,國內外學者開始對鐵皮石斛進行組織培養和快速繁殖研究。王碧琴和蓋安俊(2006)研究結果發現,鐵皮石斛的外植體在MS+6-BA 0.5~2.0 mg/L+ NAA 0.25~0.4 mg/L或2,4-D 0.25 mg/L培養基中能誘導分化叢生芽3~5倍;原球莖分化叢生芽10~15倍;壯苗后在1/2MS+NAA 0.2~0.5 mg/L中誘導生根,生根率達90%以上。Huang等(2011)探討鐵皮石斛種子萌發、芽增殖和生根的適宜培養基,認為經馬鈴薯泥、香蕉泥培養的鐵皮石斛組培苗,生長健壯,能為生產提供大量的種苗。此外,鐵皮石斛不定芽的生根培養基主要有N6+NAA 2.5 mg/L+10%土豆汁(袁正仿等,2002)、1/2MS+10%香蕉汁+0.5%AC(朱艷和秦民堅,2003)、MS+NAA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L(單芹麗等,2010)等?!颈狙芯壳腥朦c】目前,鐵皮石斛試管苗快繁的培養基配方已很成熟,影響組培快繁技術實現產業化的瓶頸是試管苗的大田移栽(溫明霞等,2007),培養健壯,尤其是生根多、根長的試管苗是提高移栽成活率的根本措施?!緮M解決的關鍵問題】采用正交試驗考察光照強度、pH和瓊脂用量對鐵皮石斛叢生苗生根效果的影響,克服單因素試驗研究的不足,優化其生根培養條件,為產業化生產中優良種苗的供應提供技術支持。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        鐵皮石斛于2010年6月采自云南省昆明地區,部分植株經誘導培養出原球莖保存于三亞市南繁科學技術研究院組織培養研究室。增殖過程中部分原球莖分化出叢生芽,挑選1 cm以上的叢生小苗進行生根試驗。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 培養基選擇 選擇1/2MS+10%香蕉汁+NAA(1.0~3.0 mg/L)+6-BA(0~0.5 mg/L)+0.5%AC+7.5 g/L瓊脂作為鐵皮石斛的壯苗生根培養基,培養條件:培養室溫度25℃,濕度50%~60%,光照強度1500 lx,每天光照12 h,pH 5.5。根據激素配比設6個處理,每處理接種15瓶,每瓶6株,重復3次。60 d后統計小苗鮮重和生根苗數,計算生根率。

        生根率(%)=生根苗數/總苗數×100

        1.2.2 培養條件篩選 在選擇培養基的基礎上,設計L9(34)正交試驗,對光照強度、pH和瓊脂用量3因素選取3水平形成9個處理對鐵皮石斛生根條件進行研究(表1),每處理接種15瓶,每瓶6株,重復3次。培養溫度25℃,培養室濕度50%~60%,每天光照12 h。

        表1 鐵皮石斛生根的試驗因素及水平

        Tab.1 Experimental factors and levels ofDendrobium officinalerooting in vitro

        


        1.2.3 統計分析 定期觀察記錄試管苗的長勢情況,使用SPSS 17.0軟件和Excel軟件進行數據統計分析。

        2 結果與分析

        2.1 不同激素處理對試管苗壯苗生根的影響

        從表2可知,接種60 d后,隨著MS培養基中NAA濃度的升高,試管苗的鮮重和生根率呈逐漸降低的趨勢,不同處理間試管苗的鮮重和生根率差異明顯;其中,MS培養基中添加NAA 1.0 mg/L(處理1)和NAA 2.0 mg/L(處理3)的試管苗長勢好,表現出生長迅速、葉片肥厚、莖粗壯、根系發達等優勢,試管苗的平均鮮重和生根率高,與其他處理間差異顯著。在添加NAA 1.0~3.0 mg/L和6-BA 0.5 mg/L組合的MS培養基中,隨著NAA濃度的升高,試管苗的鮮重和生根率不斷顯著提高,但均低于僅添加NAA的處理。

        表2 不同激素處理對試管苗的影響

        Tab.2 The impact of different hormone treatments of plantlets

        


        同列不同小寫字母表示在5%水平上的差異顯著性

        Different lowercase letters in the same column represent the significant difference at 5%level

        2.2 不同培養條件對試管苗生根的影響

        試管苗在接種13 d后,葉片變綠,開始長出白色纖細根須。接種30 d后,葉片濃綠,莖伸長2~3倍,節間明顯,根增長變粗,附有根毛。接種60 d后,大部分植株生長健壯,有的莖葉甚至頂到培養瓶瓶塞;不同處理的生根數為1~8條,根長0.5~5.0 cm,以處理5、7、9的根多、長,處理1、2、3的根生長緩慢(表3)。此外,部分鐵皮石斛試管叢生苗在接種生根培養基時已出現1~2條短根,這些叢生苗生長速度較快。

        表3 鐵皮石斛正交實驗結果

        Tab.3 Orthogonal test results ofDendrobium officinale

        


        T代表生根數均值,X代表根長均值,R代表極差

        “T”represents average rooting number,“X”represents average root length,“R”represents range

        2.3 極差分析與方差分析

        從表3可知,影響生根數的3因素主次順序為A>C>B,優水平組合為A3B2C3;影響根長的3因素主次順序A>C>B,優水平組合為A3B1C3??梢?,A因素(光照強度)對鐵皮石斛試管苗生根的影響大,其次是C因素(瓊脂用量)的影響,B因素(pH值)的影響弱。試管苗生根越多越易存活,從平均生根數上考慮,生根培養基的3因素優水平組合為A3B2C3。

        表3中3因素的極差分析結果都大于誤差項(空列),說明它們對試管苗根的生長都有不同程度的影響,需采用方差分析進一步驗證。對試管苗平均生根數進行方差分析,從表4可以看出,A因素(光照強度)和C因素(瓊脂用量)對試管苗生根數的影響較大,二者分別達極顯著水平和顯著水平,B因素(pH值)對鐵皮石斛試管苗生根數的影響較小。對試管苗平均根長進行方差分析,從表5可知,A因素(光照強度)和C因素(瓊脂用量)對試管苗根長的影響較大,二者均達顯著水平,B因素(pH值)對鐵皮石斛試管苗根長的影響較小。綜上所述,極差分析結果和方差分析結果高度一致。

        3 討論

        近年來,許多學者對鐵皮石斛人工快繁進行了大量研究,并在培養基選擇及其成分配比方面取得很大進展。本研究選用鐵皮石斛生根主流培養基,通過優化激素配比,并在此基礎上研究光照強度、pH和瓊脂用量3因素對生根效果的影響,從而確定試管苗的佳生根條件。在含10%香蕉汁的MS培養基中添加低濃度NAA時,有利于鐵皮石斛試管苗的伸長生長及根系發生,而添加6-BA和高濃度的NAA具有一定的抑制作用。在生產上,向培養基中添加1.0~2.0 mg/L NAA用于生根培養為適宜。在選擇適宜的生根培養基后,光照強度和瓊脂用量對鐵皮石斛試管苗生根的數量和長度有顯著影響,而pH值的影響不顯著。適宜的酸性條件加快了根的形成和植株對營養的吸收,達到生根壯苗的目的,本研究設定的酸性范圍(5.0~6.0)對根生長沒有顯著差異,但酸度太低或太高都不利于植株生長(陳青青等,2010),而且10%香蕉泥添加物對維持培養基pH起一定緩沖作用。在研究過程中,發現在較強光照培養條件下的試管苗根多且長,有利于試管苗移栽成活率的提高,說明光照強度大小是培養鐵皮石斛試管苗的關鍵因素之一。瓊脂的用量影響固體培養基的軟硬程度,本研究結果表明,較硬的培養基促進了根的發生和生長,這可能與鐵皮石斛喜歡附生的自然特性有關。

        表4 平均生根數方差分析結果

        Tab.4 The variance analysis of average rooting number

        


        表5 平均根長方差分析結果

        Tab.5 The variance analysis of average root length

        


        4 結論

        鐵皮石斛試管苗適宜的生根培養基為1/2MS+ 10%香蕉泥+NAA 1.0 mg/L+2%蔗糖+0.05%AC,試管苗生長健壯、根系發達;適宜的生根條件為光照強度2000 lx、瓊脂用量8 g/L、pH 5.5。

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